在《陀槍師姐IV》的故事發生十幾年之後，督察黛安娜（宣萱飾）一直安逸於檔案管理的後勤崗位，因緣際會跟元祖級陀槍師姐陳三元（滕麗名飾）、飛虎隊男神蒙漢森（陳豪飾）合力破案後，被上司韋展超（許紹雄飾）安排加入懸案小組，與一班各有「特色」的警員，在漢森帶領下追查外界不關注的懸案。漢森不滿安娜而互相鬥法，直至揭露安娜因曾被脅持而恐懼用槍，反令二人擦出愛火花！安娜重遇多年前慘遭滅門的補習學生劉達華（羅子溢飾），他卻加入了黑道……在感情與內疚推動下，安娜能否拿回手槍重新振作，成就新一代的「陀槍師姐」？